В гимназии Менделеев учился неважно. Не все предметы ему были по душе. Охотно он занимался только математикой и физикой. Отвращение к классической школе осталось у него на всю жизнь. Благоприятную почву для развития своих способностей Менделеев нашел только в Главном Педагогическом институте. Здесь он встретил выдающихся учителей, умевших заронить в души своих слушателей глубокий интерес к науке. В числе их были лучшие научные силы того времени, академики и профессора Петербургского университета: М. В. Остроградский (математика), Э. Х. Ленц (физика), А. А. Воскресенский (химия), М. С. Куторга (минералогия), Ф. Ф. Брандт (зоология). 
Самая обстановка института, при всей строгости режима закрытого учебного заведения, благодаря малому числу студентов, крайне заботливому к ним отношению и тесной связи их с профессорами, давала широкую возможность для развития индивидуальных склонностей. По окончании курса в институте Менделеев вследствие пошатнувшегося здоровья занял место учителя сначала в Симферополе, затем в Одессе, где он пользовался советами Пирогова. Пребывание на юге поправило его здоровье и в 1856 г. он возвратился в Санкт-Петербург, где защитил диссертацию на степень магистра химии: «Об удельных объемах». 23 лет от роду он делается доцентом Петербургского университета, где читает сначала теоретическую, потом органическую химию. В январе 1859 г. Менделеев был отправлен в двухгодичную командировку за границу. Он поехал в Гейдельберг, куда привлекали его имена Бунзена, Кирхгофа и Коппа, и где он работал в собственной частной лаборатории, преимущественно по вопросу о капиллярности и поверхностном натяжении жидкостей, а часы досуга проводил в кругу молодых русских ученых: С. П. Боткина, И. М. Сеченова, И. А. Вышнеградского, А. П. Бородина и др.

В 1861 г. Менделеев возвращается в Санкт-Петербург, где возобновляет чтение лекций по органической химии в университете и издает замечательный по тому времени учебник: «Органическая химия», в котором идеей, объединяющей всю совокупность органических соединений, является теория пределов, оригинально и всесторонне развитая. Книга оказалась настолько удачной, что первое ее издание разошлось в несколько месяцев и в следующем году пришлось делать второе. 
В 1863 г. физико-математический факультет Петербургского университета избирает его профессором на кафедру технологии, но он не получает утверждения от министерства, за отсутствием у него степени магистра технологии! (утверждение состоялось только в 1865 г.). 
В 1864 г. Менделеев был избран профессором Петербургского технологического института. 
В 1865 г. он защитил диссертацию «О соединениях спирта с водой» на степень доктора химии, а в 1867 г. получил в университете кафедру неорганической (общей) химии, которую и занимал в течение 23 лет. Приступив к подготовке лекций, он обнаружил, что ни в России, ни за рубежом нет курса общей химии, достойного быть рекомендованным студентам. И тогда он решил написать его сам. Эта фундаментальная работа, получившая название «Основы химии», выходила в течение нескольких лет отдельными выпусками. Первый выпуск, содержащий введение, рассмотрение общих вопросов химии, описание свойств водорода, кислорода и азота, был закончен сравнительно быстро — он появился уже летом 1868 г. Но, работая над вторым выпуском, Менделеев столкнулся с большими затруднениями, связанными с систематизацией и последовательностью изложения материала.

Сначала Дмитрий Иванович Менделеев хотел сгруппировать все описываемые им элементы по валентностям, но потом выбрал другой метод и объединил их в отдельные группы, исходя из сходства свойств и атомного веса. Размышление над этим вопросом вплотную подвело Менделеева к главному открытию его жизни, которое было названо — периодическая система Менделеева.

То, что некоторые химические элементы проявляют черты совершенно явного сходства, ни для одного химика тех лет не было секретом. Сходство между литием, натрием и калием, между хлором, бромом и йодом или между кальцием, стронцием и барием бросалось в глаза любому. В 1857 г. шведский химик Ленсен объединил по химическому сходству несколько «триад»: рутений — родий — палладий; осмий — платина — иридий; марганец — железо — кобальт. Были сделаны даже попытки составить таблицы элементов. В библиотеке Менделеева хранилась книга немецкого химика Гмелина, который опубликовал такую таблицу в 1843 г. В 1857 г. английский химик Одлинг предложил свой вариант. Однако ни одна из предложенных систем не охватывала всю совокупность известных химических элементов. Хотя существование отдельных групп и отдельных семейств можно было считать установленным фактом, связь этих групп между собой оставалась совершенно непонятной. Менделееву удалось найти ее, расположив все элементы в порядке возрастания их атомной массы. Установление периодической закономерности потребовало от него огромного напряжения мысли. Написав на отдельных карточках элементы с их атомными весами и коренными свойствами, Менделеев стал раскладывать их в разнообразных комбинациях, переставляя и меняя местами. Дело сильно осложнялось тем, что многие элементы в то время еще не были открыты, а атомные веса уже известных определены с большими неточностями. Тем не менее искомая закономерность вскоре была обнаружена. Сам Менделеев таким образом рассказывал об открытии им периодического закона. «Заподозрив о существовании взаимосвязи между элементами еще в студенческие годы, я не уставал обдумывать эту проблему со всех сторон, собирал материалы, срав нивал и сопоставлял цифры. Наконец настало время, когда проблема созрела, когда решение, казалось, вот-вот готово было сложиться в голове. Как это всегда бывало в моей жизни, предчувствие близкого разрешения мучившего меня вопроса привело меня в возбужденное состояние. В течение нескольких недель я спал урывками, пытаясь найти тот магический принцип, который сразу привел бы в порядок всю груду накопленного за 15 лет материала. И вот в одно прекрасное утро, проведя бессонную ночь и отчаявшись найти решение, я, не раздеваясь, прилег на диван в кабинете и заснул. И во сне мне совершенно явственно представилась таблица. Я тут же проснулся и набросал увиденную во сне таблицу на первом же подвернувшемся под руку клочке бумаги».

В феврале 1869 г. Менделеев разослал русским и зарубежным химикам отпечатанный на отдельном листке «Опыт системы элементов, основанный на их атомном весе и химическом сходстве». 6 марта на заседании Русского химического общества было зачитано сообщение о предложенной Менделеевым классификации элементов. Этот первый вариант периодической системы довольно сильно отличался от привычной нам со школы таблицы Менделеева. Группы располагались не вертикально, а горизонтально. Несколько элементов, как потом оказалось, были в этом первом варианте помещены не на свои места. Но все эти неточности отнюдь не должны умалять важности самого вывода: сопоставляя свойства элементов, попавших в вертикальные столбцы, можно было ясно видеть, что они изменяются периодически по мере нарастания атомного веса. Это было самое главное в открытии Менделеева, позволявшее связать воедино все казавшиеся до этого разрозненными группы элементов. Неожиданные сбои в этом периодическом ряду Менделеев совершенно правильно объяснил тем, что науке известны еще не все химические элементы. В своей таблице он оставил четыре незаполненные клеточки, однако предсказал атомный вес и химические свойства этих элементов. Он также поправил несколько неточно определенных атомных масс элементов, и дальнейшие исследования полностью подтвердили его правоту.

Первый, еще несовершенный набросок таблицы в следующие годы подвергся переконструированию. Уже в 1869 г. Менделеев поместил галогены и щелочные металлы не в центре таблицы, как раньше, а по ее краям (как это делается теперь). Все остальные элементы оказались внутри конструкции и служили естественным переходом от одной крайности к другой. Наряду с главными группами Менделеев стал выделять подгруппы. В следующие годы Менделеев исправил атомные веса 11 элементов и изменил местоположение 20. В итоге в 1871 г. появилась статья «Периодическая законность для химических элементов», в которой периодическая таблица приняла вполне современный вид. Статья была переведена на немецкий язык и оттиски ее были разосланы многим известным европейским химикам. Но, увы, Менделеев не дождался от них не только компетентного суждения, но даже простого ответа. Никто из них не оценил важности сделанного открытия. Отношение к периодическому закону изменилось только в 1875 г., когда Лекокде Буабодран открыл новый элемент — галлий, свойства которого поразительно совпадали с предсказаниями Менделеева (он называл этот неизвестный еще элемент эквалюминием). Новым триумфом Менделеева стало открытие в 1879 г. скандия, а в 1886 г. германия, свойства которых также полностью соответствовали описаниям Менделеева.

Идеи периодического закона определили структуру «Основ химии» (последний выпуск курса с приложенной к нему периодической таблицей вышел в 1871 г.) и придали этому труду поразительную стройность и фундаментальность. По силе воздействия на научную мысль менделеевские «Основы химии» смело можно сравнить с такими выдающимися сочинениями, как «Начала натуральной философии» Ньютона, «Беседы о двух системах мира» Галилея, «Происхождение видов» Дарвина. Весь накопленный к этому времени огромный фактический материал по самым разным отраслям химии был впервые изложен здесь в виде стройной научной системы. Неудивительно, что интерес к этому сочинению Менделеева оказался огромным — только при жизни автора «Основы химии» выдержали восемь изданий и были переведены на основные европейские языки.

Дмитрий Иванович Менделеев посвящал много внимания нашей нефтяной промышленности и с этой целью в 1876 году предпринимает путешествие в Америку (по поручению правительства) для ознакомления с постановкой там нефтяного дела, неоднократно посещает с той же целью и наши кавказские месторождения. Ведет ряд любопытных работ по исследованию нефти. 
В 1888 г. он изучает экономическое состояние Донецкого каменноугольного района, выясняет огромное его значение для России и предлагает ряд мер для рационального использования «будущей силы, покоющейся на берегах Донца». Результаты этих работ изложены им в ряде статей и отдельных монографий. 
В 1890 г. Менделеев покинул Петербургский университет при следующих обстоятельствах. Возникшие весной этого года студенческие беспорядки привели к выработке на студенческих сходках петиции на имя министра народного просвещения, в которой содержались исключительно пожелания академического характера. По просьбе студентов Менделеев согласился передать эту петицию министру, взяв раньше с них слово приостановить беспорядки. Бестактный ответ министра (графа Делянова ), отказавшегося рассмотреть петицию, и возобновившиеся после того беспорядки заставили Менделеева подать прошение об отставке. Просьбы коллег не смогли заставить Менделеева изменить принятое им решение. В свою очередь со стороны министра не было предпринято никаких шагов к тому, чтобы загладить свою вину перед Менделеевым и сохранить за Петербургским университетом его лучшее украшение. 
Почти насильно оторванный от науки, Менделеев посвящает все свои силы практическим задачам. При его деятельном участии, в 1890 г. создается проект нового таможенного тарифа, в котором последовательно проводится покровительственная система, а в 1891 г. выходит в свет замечательная книга: «Толковый тариф», представляющая комментарий к этому проекту и вместе с тем глубоко продуманный обзор нашей промышленности, с указанием на ее нужды и будущие перспективы. Морское и военное министерство поручают Менделееву (1891) разработку вопроса о бездымном порохе, и он (после заграничной командировки) в 1892 г. блестящим образом выполняет эту задачу. Предложенный им «пироколлодий» оказался превосходным типом бездымного пороха, притом универсальным и легко приспособляемым ко всякому огнестрельному оружию. Менделеев принимает деятельное участие в работах, связанных с Всероссийской выставкой (1896), с Чикагской (1893) и Парижской (1900) всемирными выставками. 
В 1899 г. он был командирован на уральские заводы. В результате этой поездки появилась обширная и в высшей степени содержательная монография о состоянии уральской промышленности. 
В 1893 г. Менделеев был назначен управляющим только что преобразованной по его же указаниям «Главной Палаты мер и весов» и на этом посту оставался до конца своей жизни. В главной палате Менделеев организует ряд работ по метрологии, связанных с возобновлением русских прототипов меры и веса. Особенно важны работы, касающиеся законов, управляющих колебаниями весов, и выработки приемов точного взвешивания; сюда же относится определение веса определенного объема воды и изменения удельного веса воды при изменении температуры от 0 до 30°, подготовление опытов для измерения абсолютного напряжения силы тяжести. Все эти и другие работы напечатаны в основанном Менделеевым «Временнике» главной палаты. 
К этому же периоду деятельности Менделеева относится его известная статья: «Попытка химического понимания мирового эфира» (1903), в которой он высказывает предположение, что эфир — особый химический элемент с весьма малым атомным весом, относящийся к нулевой группе периодической системы.

С 1891 года Менделеев принимает деятельное участие в «Энциклопедическом словаре» Брокгауза-Ефрона, в качестве редактора химико-технического и фабрично-заводского отдела и автора многих статей служащих украшением этого издания. В 1900 — 1902 годы он редактирует «Библиотеку промышленности» (изд. Брокгауза-Ефрона), где ему принадлежит «Учение о промышленности». С 1904 г. стали выходить «Заветные мысли» Менделеева, в которых содержится как бы его завещание потомству, итоги пережитого и передуманного по различным вопросам, касающимся экономической, государственной и общественной жизни России. 
По своему содержанию к «Заветным мыслям» примыкает и замечательное сочинение Менделеева: «К познанию России», представляющее анализ данных переписи 1897 г, и выдержавшее при жизни автора 4 издания (с 1905 г.).

По исчислению профессора В.Е.Тищенко, общее число книг, брошюр, статей и заметок, напечатанных Менделеевым, превышает 350 - из них 2/3 приходится на оригинальные работы по химии, физике и техническим вопросам. 
Менделеев в широкой мере обладал присущей истинному гению способностью объединять различные стороны научного и вообще духовного творчества и потому охотно работал в пограничных областях между химией и физикой, между физикой и метеорологией, от химии и физики, переходил в область гидродинамики, астрономии, геологии, даже политической экономии. Всякое дело, за какое бы ни брался Менделеев, каким бы узко специальным оно ни было, он захватывал широко и стремился глубоко проникнуть в сущность поставленного вопроса. Всюду он умел быть оригинальным, или, как он сам говорил, «своеобычным». От вопроса о рациональной добыче и утилизации нефти он возвышался до чисто научной проблемы о происхождении нефти — с одной стороны, до всестороннего анализа экономической жизни России — с другой; от узких задач метрологии, от выверки разновесок он восходил к проблеме всемирного тяготения. При таком широком размахе мысли и разносторонней деятельности Менделеева все, что выходило из-под его пера, было в то же время глубоко продумано и тщательно проработано. Это становилось возможным только благодаря его необычайной трудоспособности, позволявшей ему проводить за работой целые ночи, едва уделяя несколько часов на отдых. 
Так например обширный курс органической химии, по свидетельству профессора Г. Г. Густавсона, был написан Менделеевым всего в течение двух месяцев, почти не отходя от письменного стола. Таким же почти образом Дмитрием Ивановичем позднее был составлен отчет о состоянии уральской промышленности и многие его другие сочинения. 
Работая в области точных наук, особенно химии и физики, Менделеев придавал огромное значение числовым данным и потратил немало усилий и остроумия на выработку методов как для добывания этих данных путем эксперимента, так и для их математической обработки. Массу ценных указаний по этому поводу можно найти в сочинениях Менделеева, особенно в его докторской диссертации и в сочинениях: «Об упругости газов» и «Исследование водных растворов». Огромное количество труда и времени затрачивал он на сам процесс обработки опытных данных, как собственных, так и в особенности добытых другими авторами. Лица, близко знавшие Менделеева, свидетельствуют, что каждая цифра, им сообщаемая — даже с учебной целью, в «Основах химии», — неоднократно и весьма тщательно проверялась и публиковалась лишь после того, как автор получал уверенность в том, что именно ее следует считать наиболее достоверной. 
Помимо чистой химии, вообще чистой науки, Менделеева всегда интересовала и область химии прикладной, химической промышленности. Он глубоко верил в творческие силы науки на практическом поприще; он был убежден, что настанет время, когда «посев научный взойдет для жатвы народной». Будучи поборником идеи единения между наукой и техникой, Менделеев считал такое единение и тесно связанное с ним широкое развитие промышленности настоятельно необходимыми для нашего отечества, а потому всюду, где мог, горячо о том проповедывал, не только словом, но и делом, на собственном примере показывая, к каким блестящим практическим результатам может привести наука в союзе с промышленностью. 
Мысли Менделеева оказались пророческими. Кое-что в предуказанном им направлении было сделано (особенно благодаря графу Витте, который больше других видных государственных деятелей ценил Менделеева и прислушивался к его голосу).

Как учитель, Менделеев не создал и не оставил после себя школы, подобно своему знаменитому современнику А.М. Бутлерову, но зато целые поколения русских химиков могут считаться его учениками. Это, прежде всего, его университетские слушатели, а затем и несравненно более широкий круг лиц, изучавших химию по его «Основам». 
Лекции Менделеева не отличались внешним блеском, но были глубоко увлекательны, и слушать его собирался весь университет. В этих лекциях Менделеев как бы вел за собой слушателя, заставляя его проделывать тот трудный и утомительный путь, который от сырого фактического материала науки приводит к истинному познанию природы. Он заставлял почувствовать, что обобщения в науке даются лишь ценой упорного труда, и тем ярче выступали перед аудиторией конечные выводы. 
Его «Основы химии», написанные в период времени между 1868 и 1870 годами и составленные, по крайней мере, отчасти по университетским лекциям Менделеева, далеки от типа обыкновенного учебника химии. Это монументальное сочинение, в котором заключается вся философия химической науки, органически вплетенная в остов фактического материала, и, в частности, подробный комментарий к периодическому закону. Первоначально написанное для начинающих и имевшее целью «завлечь в изучение химии сколь возможно больше русских сил», оно содержит так много глубоких и оригинальных мыслей, интересных сближений, оценка которых далеко не всегда доступна для новичка, что сохраняет огромный интерес и для сложившегося химика, который, перечитывая «Основы», каждый раз найдет в них немало для себя полезного.

Менделеев всегда горячо сочувствовал высшему женскому образованию и был вначале профессором Владимирских, потом Бестужевских женских курсов, в Петербурге. 
Живо интересуясь вопросами народного образования, особенно высшего, он неоднократно возвращается к этой теме в своих трудах. Но не только организация школы интересовала Менделеева: он живо реагировал на те общественные настроения и течения, которые могли отразиться на духе и направлении школы. 
Убежденный враг мистики, он не мог не отозваться на увлечение спиритизмом, охватившее часть русского общества в 70-х годах 19 века. Критике так называемых «медиумических явлений» он посвящает особое сочинение, вышедшее в 1876 г, излагая в нем результаты работ специальной, по его же инициативе организованной комиссии.

Заслуги Менделеева перед наукой получили признание со стороны всего ученого мира. Он был членом почти всех академий и почетным членом многих ученых обществ (общее число ученых учреждений, считавших Менделеева почетным членом, доходило до 100). Однако Российская Академия Наук предпочла ему в 1880 году Ф.Ф. Бейльштейна, автора обширного справочника по органической химии — факт, вызвавший негодование в широких кругах русского общества. Несколько лет спустя, когда Менделееву вновь предложили баллотироваться в Академию, он снял свою кандидатуру. В 1904 году в день 70-летнего юбилея Дмитрия Ивановича Академия одна из первых приветствовала его через своего представителя. 
Особенным почетом имя его пользовалось в Англии, где ему были присуждены медали Дэви, Фарадэя и Копилея, куда он был приглашен (1888) в качестве «Фарадэевского» лектора, честь, выпадающая на долю лишь немногим ученым.

Менделеев скончался 20 января 1907 года от воспаления легких. 
Его похороны, организованные за счет государства, стали настоящим национальным трауром. Вскоре отделение химии Русского Физико-Химического Общества учредило в честь Менделеева две премии за лучшие работы по химии. Библиотека Менделеева, вместе с обстановкой его кабинета, была приобретена Петроградским университетом и хранилась в особом помещении, когда-то составлявшем часть квартиры Менделеева. Было принято решение о воздвижении в Петрограде памятника Менделееву, на который была собрана значительная сумма.